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生物指示劑詳解 – 理論篇


在藥品的微生物汙染控製體係中,**是極其重要的一個組成部分。**工藝的選擇、開發、驗證、監控等整個生命周期中,離不開生物指示劑的使用,隻有物理殺滅和生物殺滅效果均達到預定的標準,**工藝方可用於產品或組件的**。關於生物指示劑的使用,行業內一直存在諸多疑問,本文分兩部分對生物指示劑進行詳細的介紹,**部分重點介紹理論基礎,包括**動力學(F0值、D值等概念和計算)、**法的選擇和監控、物理殺滅和生物殺滅的一致性和驗證等內容;**部分重點介紹生物指示劑的種類、包裝形式、選擇、使用和質量控製等內容。


生物指示劑(Biological Indicators),根據ISO11138的定義 - test system containing viable microorganisms providing a defined resistance to a specified sterilization process,即含有活的微生物的測試係統,其為特定的**工藝提供確定的抵抗力。2015年版《中國藥典》四部1421**法的定義為“生物指示劑係一類特殊的活微生物製品,可用於確認**設備的性能、**程序的驗證、生產過程**效果的監控等。”從定義可以看出,生物指示劑是一類含有活的微生物的測試係統,其主要用於**工藝的驗證或監控。

生物指示劑是用於**工藝,在介紹其之前,玉米视频下载安卓版无限观看需要了解**的原理,以便理解生物指示劑的特性、使用和質量控製。

一、**原理              

所謂**,即“用適當的物理或化學手段將物品中活的微生物殺滅或除去,從而使物品殘存活微生物的概率下降至預期的無菌保證水平的方法。(2015年版《中國藥典》)”**主要有殺滅和除去兩種方式,前者是通過物理或者化學的手段殺滅產品中的微生物,後者則是通過一定的分離機製(目前主要是過濾的方式)將微生物從產品中分離。這兩種方式的機理不同、動力學不同,其適合的模型也不同。本文所闡述的主要是前者,即殺滅的方式去除微生物。

當前製藥工業所用的**方式很多,包括熱力學**,如濕熱**,如蒸汽**、過熱水**;幹熱**;輻照**,如γ射線**、X射線**、電子束**;氣體**,如環氧乙烷**、氣態過氧化氫**、甲醛**、臭氧**等。這些**方式的**介質不同,殺滅微生物的機理也不同,相應的工藝開發、工藝控製和工業驗證也不盡相同。但是,除了輻照**外,從**模型的研究、**工藝的驗證和生物指示劑的選擇和使用來看,這些**方式都有共通之處。因此,本文以研究*為深入的濕熱**為例,詳細介紹**動力學和**驗證,從而深入了解生物指示劑在其中的作用。

濕熱**主要是通過高溫使得微生物的蛋白質、核酸等分子發生變性,從而殺滅微生物。這個過程與很多因素有關,如**溫度、**時間、微生物的種類和數量、微生物所處的環境、蒸汽質量等等。為研究**的動力學,玉米视频下载地址把微生物的數量(N)對**時間(t)作曲線,關係如下:

這一曲線關係不利於**的研究,如果把微生物的數量用對數值進行處理(lgN),再對時間(t)作曲線,則會得到以下的曲線

這裏玉米视频下载安卓版无限观看可以看到,兩者(微生物數量對數值lgN和**時間t)成直線關係。這一轉換大大方便了**動力學的研究,也構成了整個濕熱**模型的基礎。基於此模型,玉米视频下载最新版了解以下幾個重要的參數:

Ø  微生物的耐熱性,D值的概念:

自然界的微生物種類多種多樣,不同微生物的耐熱性是不一樣的,反映在**曲線(lgN~t)上,耐熱性弱的微生物lgN隨著時間下降較快,而耐熱性強的微生物lgN隨溫度下降的速度慢。這一點*直接的反映便是直線的斜率(k),如果直線的斜率(優良值,如下圖)越大,微生物lgN下降越快,耐熱性越低,反之亦然

雖然斜率k值可以反應這一關係,但是為了便於理解和日常運用,玉米视频下载最新版在斜率k的基礎上進行一個簡單的變換,引入D值的概念。令D=−1/k=△t/△lgN,即,D值可以理解為微生物數量下降一定的對數值所需要的時間。當△lgN為1時,所需要的**時間恰好等於D值,故D值定義為使微生物下降一個對數值所需要的**時間。因微生物數量下降一個對數值與殺滅90%的意義相同,故D值又稱之為90%殺滅時間。這樣的簡單轉換,使得D值的定義易於理解,在**工藝中也方便應用,這一點在後麵的介紹中會得到體現。


    D值的影響因素很多,包括(但不限於):

  • 生物的種類和形式,一般芽孢杆菌以芽孢的形式存在時,耐熱性強,D值大;

  • 微生物所處的形式(對於生物指示劑而言,即為生物指示劑的載體,如紙載式、不鏽鋼片、液體等);

  • 包裝形式;

  • 溶液種類(對於處於液體中的微生物而言);

  • **的溫度。


有了D值,便可以對**後的微生物數量進行計算。初始汙染菌數為N0表示,**後的汙染菌數用NF表示,某一溫度下的D值用DT表示,**時間用t表示,則:

          (lgN0–lgNF) = t/DT   ,也即lgNF =lgN0 –t/DT

假定某一物品初始汙染菌數N0 為106,某一溫度T下的D值為2.5min,則:



       ***1分鍾後,lgNF= lgN0–t/DT = 6–1/2.5 = 5.6

       * **2分鍾後,lgNF= lgN0–t/DT = 6–2/2.5 = 5.2


 這裏可以看到,隨著**時間t的無限增加,lgNF變得無窮小,但NF是始終大於0的,也就是說,優良的無菌(NF為0)理論上來說是不存在的。在製藥行業中,NF為10-6,也就百萬分之一便是終端**產品可以接受的無菌保證(概率)水平。因此,在這個案例中,如果要達到百萬分之一的無菌保證水平,所需要的**時間為:

    -6 = 6–t/2.5, 即**時間t需要30分鍾。


Ø 微生物的耐熱性(D值)與溫度的關係,Z值的概念

引入D的模型隻考慮了同一溫度下的**曲線,即**過程中溫度沒有波動時微生物數量lgN與**時間t之間的關係。事實上,產品**時是無法將**溫度控製在某一恒定溫度的。而D值,即微生物的耐熱性,是與溫度直接相關的,溫度越高,D值越小,溫度越低,D值越大。如果要研究產品的**過程,玉米视频下载最新版就需要找到D值與溫度的關係。

這裏,玉米视频下载最新版測定同一微生物在不同**溫度下的D值(測試方法將在本專題的**部分介紹),把微生物的D值的對數值lgD(縱坐標)與產品的溫度T(橫坐標)作曲線,會得到以下直線關係:


這裏可以看出,lgD與**溫度T是成直線關係的(模型與lgN~t相同)。通過直線可以看出,lgD與T的負相關性與玉米视频下载安卓版无限观看研究D值的來源正好相同。同樣,為了便於理解和日常運用,玉米视频下载安卓版无限观看也不直接用斜率k來反應這樣的關係,而是引入Z值的概念;同樣,令Z=−1/k=△T/△lgD,當lgD等於1時,所需要提高的溫度△T恰好等於Z值。因此,Z值的定義即為D值下降一個對數值所需要提高的溫度。

研究表明,大部分的微生物Z值均在10 ℃左右(濕熱**),因此,在無特殊說明的情況下,為簡化計算,Z值均默認為10 ℃。


Ø 不同溫度下**時間的換算,等效**時間FTref的概念


**工藝雖然有溫度波動,但是有了Z值的概念,玉米视频下载地址便可以將不同溫度下的等效**時間通過D值進行換算。將不同溫度下得**時間用FTT表示,要換算120 ℃下的**時間,等效於121 ℃下的**時間,可根據lgN~T的關係曲線:

                                 F121 = D121×△lgN

                                  F120 = D120×△lgN

所謂等效**時間,即**效果相同所需要的**時間,因此兩者的△lgN相等。兩等式相除,得到:

這個公式需要玉米视频下载最新版考察D值與溫度的關係,這恰好是Z值的概念。根據考察Z值時D值與溫度的關係,玉米视频下载链接地址得到:

故,120 ℃**1分鍾,其相當於在121 ℃下的**時間為0.79分鍾。

同理,玉米视频下载最新版可以計算出**過程中任何溫度(T)下的**時間(FT)相當於其在121 ℃下的等效**時間(F121),即:

                            F121 = FT×10(T-121)/Z

同樣,玉米视频下载最新版也可以將**過程中的任何溫度(T)下的**時間(FT)換算為其在任何參考溫度Tref下的等效**時間(FTref),即:

                            FTref  = FT×10(T-Tref)/Z

Ø **工藝的**能力,F0值的概念


如果玉米视频下载地址把所有的**工藝都統一換算為同一溫度下的**時間,則不同**工藝的**能力便有了可比性,也可以針對**能力製定量化的標準,這一參考溫度便是121.1℃。如果把**過程中每一時刻的**時間都換算為121.1℃的**時間,再進行累積,得到整個**過程在121.1℃下的**時間,這一時間便是F0值(ISO17665,Z值定義為10℃)。


二、**工藝的**能力要求

前麵玉米视频下载安卓版无限观看介紹過,產品的無菌保證水平(SAL)為10-6。而**工藝要達到這樣的SAL,所需要的**能力取決於**前的微生物負載(**前的微生物數量)和微生物負載的耐熱性。製藥行業一般都有嚴格的微生物汙染控製措施,**前的微生物負載(N0)一般不會超過1066,故106便認為是微生物負載的*差條件;自然界中很少會發現D121℃大於0.5分鍾的微生物,故D121℃值為1分鍾,便認為微生物負載耐熱性的*差條件。

  • 過度殺滅法是將微生物負載的數量和D值同時取*差條件,即數量為106,D121℃值為1分鍾,此時,要達到SAL為10-6的無菌保證水平,F0 應不低於:

F0 = D121℃×(lgN0-lgNt)= 1×(6-(-6)) = 12分鍾

備注:EMA要求不低於15分鍾。

此時,由於微生物負載的數量和耐熱性都取*差條件,日常**時,對於二者的監控不是必須的。

  • 殘存概率法中,如果微生物數量不取*差條件,耐熱性取*差條件。一般情況下,微生物負載會控製在1-100的水平,故取初始數量為102;D121℃仍取*差條件,即1分鍾。此時,要達到SAL為10-6的無菌保證水平,F0應不低於:

F0= D121℃×(lgN0-lgNt) = 1×(2-(-6)) = 8分鍾

     這也是GMP規定F0值一般不低於8分鍾的原因。此時,微生物負載的數量    不是取的*差條件,日常**時需要對其進行監控;而耐熱性取*差條件, 故對耐熱性的監控不是必須的。

  • 當微生物負載的數量和耐熱性都不取*差條件時,微生物負載的數量同上述原因仍取102,耐熱性需要根據產品的的汙染菌情況確定,假定經過檢測,負載的D121℃*高為0.3分鍾,**工藝按照D121℃為0.4分鍾進行設計(稍高於實際檢測的*高值),則,要達到SAL為10-6的無菌保證水平,F0應不低於:

F0= D121℃×(lgN0-lgNt) = 0.4×(2-(-6)) = 3.2分鍾

此時,微生物負載的數量和耐熱性都不是取*差條件,日常**時需要對兩者同時進行監控。

三、**工藝驗證中的生物指示劑

根據2010年版GMP的要求,“第六十三條 任何**工藝在投入使用前,必須采用物理檢測手段和生物指示劑,驗證其對產品或物品的適用性及所有部位達到了**效果。”因此,在驗證某一**工藝時,不僅僅要采用物理的檢測手段(對於濕熱**而言,主要是溫度,還包括壓力、蒸汽質量等),還需要采用生物指示劑進行檢測,以確保**工藝達到預期的**效果。單純的物理測試,一方麵其檢測的參數有限,不能反應所有的影響因素對於**工藝的影響。常見的濕熱**,主要檢測的參數為溫度和壓力,但是,蒸汽質量(過熱值、幹燥度、不凝氣體)、產品的特性(微生物的耐熱性與其所處的環境相關)等對於**效果的均有影響,同時,物理檢測基於前麵所述的理論模型進行預測的,實際狀況與理論模型不一定完全契合。因此,要驗證**工藝,還需要用生物指示劑進行考察,以確保物理殺滅效果(用FPHY)和生物殺滅效果(FBIO)具有一致性。這便是生物指示劑的選擇基礎。

四、生物指示劑的選擇-物理殺滅和生物殺滅的關係

選擇生物指示劑的選擇的主要依據是證明FPHY和FBIO具有一致性,即物理殺滅效果能夠實際殺滅相應的生物指示劑。實際操作過程時,玉米视频下载最新版通常會選擇合適的生物指示劑,經過**工藝**後進行培養,如果全部呈陰性,那麽玉米视频下载链接地址判定**工藝符合預定標準。

假定某一**工藝,其物理殺滅效果(FPHY)為F0值不低於12分鍾,理論來說,為證明一致性,所使用FBIO也應為12分鍾,這樣才能證明兩者是一致的。假定所選擇的生物指示劑的D121℃為2分鍾,數量為106,則其殺滅所需要的時間理論上為:

               FBIO= D121℃×(lgN0-lgN) = 12分鍾


看上去,FPHY和FBIO的時間剛好相當,可選擇該生物指示劑進行**的驗證。然而,在介紹無菌保證水平的時候玉米视频下载安卓版无限观看知道,微生物存活是一個概率問題。在這個案例中,當FBIO為12分鍾時,**後的汙染菌數量NFF為:


       lgNF =lgN0–t/DT = 6–12/2 = 0,則 NF=1


也就是說,產品中依然有菌,生物指示劑**後培養時很大概率呈陽性。那麽,問題來了,生物指示劑要如何選擇,才能證明FPHYHY與FBIO是一致的?根據EP9.0的要求,在進行**工藝驗證時,驗證時時所選擇的**時間(tvl),應將生物指示劑殺滅到10-1到10-3的水平,即   

     

    以上述生物指示劑為例,為驗證FPHYY和FBIO是一致的,選擇的FPHY應將生物指示劑**後的數量NF下降至-1至-3個log值(原來下降至0個log值),即:

  

即:2×(6+1) ≤tvl≤2×(6+3)

   即:14≤tvl≤18 (分鍾)


而PDA則建議將生物指示劑殺滅到10-2的水平。(備注:將生物指示劑殺滅到102所需要的時間,即**結束後,生物指示劑全部呈陽性的時間,為生物指示劑的存活時間,survival time;將生物指示劑殺滅到10-4所需要的時間,也即生物指示劑**後全部呈陰性的時間,為生物指示劑的殺滅時間, kill time)。如果驗證時,選擇的**時間tvl大於kill time,則無法證明FPHY和FBIO具有一致性。這時,玉米视频下载地址可以選擇減少**時間(如半循環),或降低**溫度(這時需要知道生物指示劑在實際**條件下的Z值)來進行**工藝的驗證,當然也可以選擇合適的生物指示劑,使得該生物指示劑的survival time和kill time滿足**參數的要求。


總結:本文介紹了**的原理、**的動力學、**參數和**工藝的選擇,在此基礎之上,介紹了如何選擇合適的生物指示劑,以驗證物理殺滅和生物殺滅的一致性。下一部分,玉米视频下载最新版會根據此理論基礎,介紹生物指示劑的種類、選擇、使用和質量控製。






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